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脂質體2000轉染DNA的操作過程

更新時間:2015-01-13  |  點擊率:2248
   脂質體2000適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下zui方便的轉染方法之一。轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

  用脂質體2000進行轉染時,首先需優化轉染條件,應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做:先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始,按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者*的劑量,確定出轉染時間(2~24小時)。因LR對細胞有一定的毒性,轉染時間以不超過24小時為宜。

  細胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

  快速脂質體轉染法操作步驟如下:

  (1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時,使其達到50~60%板底面積。

  (2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下:

  ①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。

  ②旋轉1秒鐘,再加入脂質體懸液,旋轉。

  ③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結合在脂質體上。

  (3)棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物,37℃培養3~5小時。

  (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續培養14~24小時,

  (5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養24~48小時。

  (6)用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。

  穩定的脂質體轉染方法如下:

  (1)接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉染。

  (2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。

  (3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養48小時。

  (4)吸出DMEM,用G418選擇培養液稀釋細胞,使細胞生長一定時間,篩選轉染克隆,方法參照細胞克隆篩選法進行。

  注:脂質體,即lipofectin regeant,LR

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